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Summary

La crescente incidenza dell’insufficienza cardiaca grave e i limiti del trapianto di cuore e del cuore artificiale impiantabile giustificano la ricerca di opzioni alternative. L’autocostruzione del cuore potrebbe essere uno di questi. Si basa sull’uso di una matrice extracellulare derivata da un cuore animale e riseminata con cellule in grado di ricostituire un patrimonio contrattile, vascolare e valvolare compatibile con la normale funzione cardiaca. Anche se le tecniche di decellularizzazione sono ormai ben padroneggiate, i problemi posti dalla scelta del tipo di cellule capaci di generare i vari costituenti del tessuto cardiaco (cardiomiociti contrattili, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, miofibroblasti) e dalla loro modalità di trasferimento ottimale non sono ancora risolti. Inoltre, la ricolonizzazione della matrice non dipende solo dal fenotipo delle cellule utilizzate; è anche influenzata dalla natura dei segnali biochimici emessi da questa matrice e dal suo stato fisico e la modulazione di questi due fattori è una strategia in grado di migliorare fortemente le prestazioni contrattili dell’organo così auto-costituito. La complessità di questi problemi rende la sostituzione completa del cuore con un biomateriale in sostituzione del trapianto tradizionale una prospettiva incerta e lontana. D’altra parte, il perseguimento di questo obiettivo ha l’interesse di stimolare lo sviluppo di tecniche di ingegneria tissutale e, in questo contesto, è più realistico sperare, in un lasso di tempo che è probabilmente abbastanza vicino, per sostituzioni parziali del cuore da matrici ricellularizzate che vengono a rinforzare porzioni di miocardio in crisi e forse anche costituire sostituti per bioprotesi valvolari attuali.

Sommario

La crescente incidenza dell’insufficienza cardiaca e i limiti del trapianto cardiaco e dei cuori artificiali totalmente impiantabili giustificano la ricerca di terapie alternative. L’autocostruzione del cuore potrebbe essere uno di questi. Si basa sull’uso di un’impalcatura decellularizzata di origine animale riseminata con cellule in grado di ricostituire un modello contrattile, vascolare e valvolare che consente una normale funzione cardiaca. Mentre le tecniche di decellularizzazione sono attualmente ben controllate, la scelta del tipo di cellule per generare i diversi costituenti del tessuto cardiaco (cardiomiociti, cellule endoteliali, cellule vascolari lisce, miofibroblasti), e il modo ottimale di trasferimento delle cellule, sono ancora lontani dalla chiarezza. Inoltre, la ricolonizzazione dello scaffold non dipende solo dal fenotipo delle cellule innestate: è anche influenzata dalla natura dei segnali biochimici emessi dallo scaffold e dallo stato fisico del substrato. La modulazione di questi due fattori può influenzare la performance contrattile dell’organo auto-costruito. La complessità di queste sfide è tale che la sostituzione totale del cuore con un organo auto-costruito è, nel migliore dei casi, una prospettiva lontana. Tuttavia, il continuo perseguimento di questo obiettivo stimola lo sviluppo di tecniche di bioingegneria, e la sostituzione parziale del tessuto cardiaco con scaffold seminati da cellule appare più fattibile. Le applicazioni potrebbero includere il rafforzamento del miocardio infartuato e, eventualmente, la sostituzione della valvola cardiaca.

La rilevanza clinica di questo concetto di organo autocostruito è illustrata da due cifre: in Francia, ci sono circa diecimila nuovi casi di insufficienza cardiaca grave ogni anno, cioè refrattaria ai trattamenti farmacologici attuali, ed è prevedibile che questa incidenza continuerà ad aumentare con l’invecchiamento della popolazione e il miglioramento della prognosi dell’infarto miocardico, che espone un maggior numero di sopravvissuti alla comparsa tardiva dell’insufficienza ventricolare sinistra. La prognosi di questa condizione rimane complessivamente grave, con il 50% dei pazienti morti a quattro anni e il 40% dei pazienti che muoiono o vengono riospedalizzati entro un anno dal ricovero per insufficienza cardiaca. Anche se il trapianto di cuore rimane l’unico trattamento radicale per gli stadi più avanzati della malattia, la carenza di donatori e le complicazioni di una pesante immunosoppressione limitano necessariamente le sue indicazioni. In ogni caso, il numero annuale di trapianti di cuore in Francia oscilla intorno ai trecentocinquanta, senza alcuna speranza realistica di vederlo aumentare. Il rimodellamento chirurgico del ventricolo sinistro è destinato solo a forme anatomiche specifiche e i risultati negativi recentemente riportati dallo studio STICH (assenza di beneficio del rimodellamento ventricolare sinistro associato alla chirurgia di bypass coronarico rispetto alla sola rivascolarizzazione) porteranno senza dubbio a una revisione delle indicazioni per questo tipo di procedura. L’assistenza meccanica ventricolare rimane principalmente una soluzione di supporto temporaneo in attesa di un trapianto anche se, grazie alla miniaturizzazione dei dispositivi a flusso continuo, il suo utilizzo come trattamento definitivo ha recentemente fatto progressi sostanziali (tasso di sopravvivenza: 58% a due anni). È vero che la risincronizzazione biventricolare è un trattamento simpatico efficace, ma si rivolge solo a una categoria mirata di pazienti in cui fallisce nel 20-30% dei casi. Infine, non c’è stato alcun progresso reale nel campo farmacologico negli ultimi dieci anni.

C’è quindi un reale bisogno di nuove opzioni terapeutiche. In questo contesto, gli xeno-trapianti, nonostante le speranze suscitate dalla possibilità tecnica di creare animali transgenici i cui organi potrebbero essere meglio tollerati nell’uomo, stanno facendo pochi progressi a causa della complessità delle sfide immunologiche persistenti e il peso crescente dei vincoli di sicurezza può rendere le autorità di regolamentazione ancora più diffidenti sul rischio di epizoozie. La terapia genica è ancora nella sua infanzia in questo campo e la complessità dei meccanismi neuro-ormonali coinvolti nell’insufficienza cardiaca non necessariamente si presta bene a un approccio i cui successi, fino ad oggi, sono stati principalmente in malattie a singolo gene. La terapia cellulare avrà senza dubbio il suo posto, ma in forme intermedie, cioè in pazienti che conservano ancora un capitale sufficiente di cellule contrattili. La ricerca in questo campo ha comunque avuto l’interesse di evidenziare il ruolo cruciale giocato dalle strutture di supporto nella sopravvivenza, proliferazione e differenziazione delle cellule innestate, aprendo così la strada a un’ingegneria tissutale che combina cellule e matrici e che è alla base del concetto di organo autocostruito.

Problemi tecnici del cuore autocostruito

Tecnicamente, questo concetto comporta due fasi temporalmente distinte.

La prima è la decellularizzazione dell’organo bersaglio, eseguita con successo dal team di D. Taylor su un cuore di ratto mediante perfusione chimica detergente e più recentemente estesa dallo stesso gruppo a grandi cuori di mammiferi. L’elettroporazione si è anche dimostrata efficace, almeno nel caso del fegato, nel raggiungere questo obiettivo di scomparsa totale di tutto il materiale cellulare, un prerequisito per il potenziale utilizzo di organi allo- o addirittura xenogenici, mantenendo l’integrità biochimica (contenuto di collagene, fibronectina, laminina) e fisica (orientamento delle fibre) della matrice extracellulare, la permeabilità dell’albero vascolare e la competenza delle valvole.

La seconda fase, più complessa, è quella della ricellularizzazione. Pone, schematicamente, due problemi: la scelta delle celle e il loro modo di trasferimento.

Le specifiche imposte alle celle sono effettivamente vincolanti. In primo luogo, è necessario ricostituire la diversità delle popolazioni cellulari presenti nel cuore: i cardiomiociti, che mentre rappresentano, in volume, circa l’80% del cuore, costituiscono, in numero, solo un terzo delle cellule del tessuto cardiaco, essendo le altre popolazioni costituite da miofibroblasti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce. Concettualmente, sono possibili tre strategie:

– l’uso di un’unica popolazione di cellule pluripotenti in grado di dare origine a tutti i tipi di cellule del cuore sotto la sola influenza di segnali chimici e fisici emessi dalla matrice extracellulare; questo approccio non sembra realistico; – l’uso di cellule adulte già differenziate nei lignaggi di destinazione; in questo quadro, l’ottenimento di fibroblasti e cellule vascolari può essere relativamente ben controllato, soprattutto perché possono anche essere raccolte dal futuro “destinatario” dell’organo ricostituito (con le limitazioni inerenti ai prodotti autologhi: funzionalità variabile, complessità logistica e costi), come è stato realizzato con successo per realizzare tubi vascolari impiantati in pazienti emodializzati; il problema è naturalmente più complesso per ottenere cellule cardiogene che non solo devono possedere proprietà intrinsecamente contrattili, ma anche essere capaci di accoppiarsi tra loro, battere sincronicamente e modulare la loro frequenza in risposta a stimoli neuroumorali o farmacologici. Tuttavia, oggi sappiamo che la plasticità delle cellule somatiche adulte è limitata e non permette loro di differenziarsi in cardiomiociti. Questo è possibile solo con cellule pluripotenti, che sono in grado di acquisire un fenotipo cardiaco sotto l’influenza di appropriati segnali cardioinduttori. Queste cellule pluripotenti possono essere cellule staminali embrionali umane il cui carattere allogenico pone il problema del rigetto (indipendentemente da qualsiasi discussione etica) o cellule somatiche adulte autologhe indotte alla pluripotenza al prezzo di una riprogrammazione poco efficiente e ancora poco controllata a causa della possibile origine di aberrazioni genetiche ed epigenetiche. Il paradosso finale è che la natura autologa di queste cellule le espone a un rischio di rigetto legato alla comparsa, a seguito della riprogrammazione, di antigeni eventualmente identificati come estranei dal sistema immunitario del ricevente. È importante sottolineare che qualunque sia l’origine di queste cellule pluripotenti, il loro uso clinico implica una fase di pre-differenziazione in vitro, poi una selezione per utilizzare solo progenitori cardiogenici (che, a seconda della tecnica di pre-differenziazione, possono essere a stadi più o meno avanzati di differenziazione cardiaca) ed eliminare così qualsiasi “contaminazione” da parte di cellule che, essendo sfuggite a questa pre-orientazione, avrebbero mantenuto un carattere pluripotente e quindi un potenziale di proliferazione tumorale dopo il trapianto. Più recentemente, è stata proposta una conversione diretta di cellule adulte (fibroblasti) in cardiomiociti, senza passare nuovamente per lo stadio di cellula pluripotente, grazie all’uso di fattori di crescita o geni; per quanto interessante possa essere in termini di comprensione dei meccanismi dello sviluppo cardiaco, questo approccio sembra ancora lontano da possibili applicazioni cliniche; – Infine, la terza strategia, intermedia, consiste nell’utilizzare un’unica popolazione di cellule progenitrici allo stadio mesendodermico che, a seconda dei segnali provenienti dal tessuto ospite, può completare la sua differenziazione in situ nei tre tipi cellulari principali (cardiomiociti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce). Va notato che questi segnali cardioinduttori non sono esclusivamente di natura chimica; anche lo stato fisico della matrice gioca un ruolo importante, una matrice flessibile il cui modulo di elasticità simula quello del tessuto cardiaco embrionale stimolando la differenziazione cardiogenica delle cellule in misura maggiore di una matrice più rigida. Questa differenziazione può anche essere modulata dall’attaccamento alla matrice di motivi che stimolano l’espressione di molecole di adesione cellulare e dalla sua sensibilità alle metalloproteasi . Inoltre, anche se le proteine costitutive della matrice extracellulare sono altamente conservate tra le specie, resta da garantire che l’innesto di cellule umane su un’impalcatura di origine animale sia un processo funzionalmente perenne e non suscettibile di alterazioni a lungo termine da parte di risposte infiammatorie o immunologiche.

Il secondo problema è quello del trasferimento delle cellule sull’impalcatura che dovrebbero ricolonizzare. Mentre la perfusione di cellule con intento vascolare sembra logica per ricostituire l’endotelio, l’iniezione intramurale di cellule con intento cardiogeno è meno ovvia. Infatti, abbiamo imparato dalla terapia cellulare che l’iniezione, a causa della dissociazione proteolitica preliminare delle cellule che coinvolge, le predispone alla morte per apoptosi. Se questo fenomeno rappresenta già una grave limitazione quando si tratta di ricolonizzare una zona circoscritta del miocardio, come si propone di fare il trapianto di cellule, diventa ancora più problematico quando l’obiettivo diventa quello del ripopolamento dell’intero organo. Un’ulteriore difficoltà è che questo ripopolamento non mira solo a fornire il contingente numerico di cellule necessario per la contrazione del futuro cuore ricostituito; deve anche permettere un allineamento di queste cellule, sia tra di loro che in relazione alla loro matrice di supporto, ottenendo una struttura anisotropa, una proprietà che caratterizza il cuore e condiziona ampiamente l’efficienza della sua funzione contrattile. Il ristabilimento di un’innervazione fisiologicamente rilevante e le modalità di drenaggio linfatico rimangono altri problemi irrisolti. Nel complesso, la strada da percorrere è illustrata dai risultati del lavoro seminale di Ott e Taylor: Dopo l’iniezione di 50-75 milioni di cardiomiociti neonatali, fibrociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce mediante cinque iniezioni dirette nella matrice di cuori di ratto decellularizzati, perfusione attraverso la radice aortica di questi stessi cuori di venti milioni di cellule endoteliali aortiche e cultura in un bioreattore (da 8 a 28 giorni), il tasso di ricellularizzazione per sezione istologica è 34% e mentre l’osservazione delle risposte elettriche e meccaniche alla stimolazione fornisce la prova del concetto, la forza contrattile generata è solo circa 2% di quella di un cuore di ratto adulto e 25% di quella di un feto umano di quattro mesi.

Perspettive

La sostituzione completa di un cuore umano con un altro cuore fatto di matrice, di origine animale, e seminato da cellule capaci di organizzarsi strutturalmente e funzionalmente per dotarlo di una efficiente attività meccanica, è quindi una prospettiva ancora incerta e comunque certamente lontana. D’altra parte, lo sviluppo di questa tecnologia, anche se non raggiunge l’obiettivo finale, ha importanti conseguenze nel campo dell’ingegneria dei tessuti. Infatti, la padronanza delle tecniche di detersione e di semina ha già permesso lo sviluppo di biomateriali compositi in due indicazioni principali in chirurgia cardiaca. Il primo riguarda la sostituzione di una porzione di miocardio. Sono stati stabiliti i vantaggi di chiudere una perdita di sostanza nel ventricolo destro con una matrice extracellulare da sola (la ricolonizzazione si basa sul reclutamento di cellule endogene) o seminata con cellule staminali mesenchimali. L’estensione prevedibile di questo approccio è il rinforzo intraoperatorio di un’area infartuata con una matrice seminata con cellule staminali con potenziale di differenziazione cardiomiogena o l’iniezione diretta con catetere dello stesso tipo di matrice con lo scopo di ripristinare la funzionalità nell’area inizialmente acinetica. Fino ad oggi, le matrici utilizzate sono state principalmente derivate dalla sottomucosa intestinale o dalla vescica dei maiali, ma il riconoscimento di una specificità tissutale della matrice extracellulare si sta ora indirizzando maggiormente verso matrici derivate dal cuore stesso di questi animali.

La seconda indicazione riguarda le valvole cardiache. L’obiettivo qui è di avere valvole biologiche che probabilmente, soprattutto nei bambini e nei giovani adulti, degenereranno meno rapidamente delle attuali bioprotesi. Lo schema generale è quello di utilizzare una matrice, biologica (allo- o xenogenica) o polimerica, e di seminarla con cellule, miofibroblasti quindi cellule vascolari di varia origine (midollo, cordone ombelicale). Progressi indiscutibili sono stati fatti nella caratterizzazione dei materiali adatti e nelle tecniche di semina in bioreattore, ma nonostante i numerosi lavori sperimentali incoraggianti, l’esperienza clinica con i tubi valvolati prodotti da questa tecnica di ingegneria tissutale rimane ad oggi limitata e inconcludente.

CONCLUSIONE

Il cuore completamente ricostruito da una matrice e cellule autologhe come un sostituto completo per il trapianto è un obiettivo lontano che pone ancora molteplici problemi tecnici e la cui rilevanza clinica e applicabilità rimane discutibile fino ad oggi, soprattutto se un progresso significativo è fatto nei prossimi anni nel campo del cuore artificiale completamente impiantabile. D’altra parte, l’uso di matrici ricellularizzate per la sostituzione parziale del miocardio, dei grandi vasi o delle valvole, sembra più realistico e potrebbe nel prossimo futuro trovare il suo posto nell’arsenale di biomateriali per la terapia cardiaca.

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